venerdì 26 maggio 2017

Articoli Genetica Clinica/Medica Ottobre 2016. R. Tenconi



Scelta di articoli di Genetica Clinica/Umana pubblicati in Ottobre 2016 nelle seguenti riviste: British Medical Journal, Lancet, Lancet Neurology, Nature, Nature Biotechnology, Nature Genetics, Nature Medicine, Nature Neuroscience, Nature Reviews Genetics, Nature Reviews Neuroscience, Nature Reviews Neurology (new entry), NEJM, PNAS, Science & Cell.

ARTICOLI DI INTERESSE
Quando l’esoma fallisce:
Mutations in SNORD118 cause the cerebral microangiopathy leukoencephalopathy with calcifications and cysts. Nature Genetics 2016;48:1185 (molti AA, di cui 2 italiani e due pz italiani). Una malattia segnalata nel 1996 in 3 bambini con una progressiva degenerazione cerebrale con microangiopatia caratterizzata da vasi sanguigni simil-angiomatosi con gliosi e deposizione di fibre Rosenthal con neuroimmagini di leucoencefalopatia, calcificazioni intracraniche e cisti, a trasmissione AR (LCC, MIM #614561). In questo lavoro gli AA hanno raccolto in 12 anni DNA di 40 pz con età di presentazione dall’infanzia a 54 anni di 33 famiglie prevalentemente di origine europea, con, stranamente data la rarità della condizione, una bassa proporzione di genitori consanguinei (3/33). L’analisi esomica di 18 pz non ha consentito di identificare il gene malattia, identificazione resa possibile dall’analisi di linkage e dell’aplotipo di 5 coppie di fratelli affetti con genitori non consanguinei e di 2 figli di due famiglie con genitori consanguinei. Riconosciuta la probabile sede delle varianti in un segmento di 1.2 Mb del cromosoma 17, sono stati rivalutati ma senza successo i risultati dell’esoma. Ma il sequenziamento mediante cattura di 3 Mb del genoma del cromosoma 17 ha consentito di individuare in ogni pz due varianti a bassissima frequenza del gene SNORD118. Il ricorso al sequenziamento Sanger ha confermato nell’intero campione di pz la presenza di mutazioni bialleliche del gene. Tredici delle 36 varianti ritenute patogene erano nuove (non presenti nel database EsAC), 11 varianti sono state riscontrate in più di una famiglia. Studi funzionali In vitro functional studies of several selected variants showed that they either impaired transcription, reduced binding to the SNU13 (601304) gene, or interfered with processing of the SNORD118 precursor RNA, consistent with a loss-of-function effect.in vitro dimostrano che le varianti modificano la trascrizione, riducendo il legame al  gene SNU13, o interferendo con il processamento dell’RNA del gene, quindi con perdita di funzione. Questa omogeneità genetica contrasta con l’ampia variabilità (nascita-60 anni) dell’esordio della patologia, variabilità che potrebbe essere dovuta alla presenza di alleli ipomorfi. Il gene SNORD118 è un gene non codificante proteine e codificante box C/D snoRNA U8, piccoli RNA nucleolari della biogenesi e funzione ribosomiale. Quindi una nuova ribosomopatia. Particolarmente interessante per la Genetica Medica la considerazione finale: che mutazioni interessanti l’espressione di U8 snRNA (SNORD118) sono essenziali per l’omeostasi cerebrale vascolare e, soprattutto, le difficoltà che talora si incontrano nell’individuare con NGS la(e) variante(i) causativa(e) in sedi non codificanti proteine, dove gli algoritmi in silico per stimarne la patogenicità possono fallire.

Phenotype is king, researchers say, after 20 family members have condition misdiagnosed. BMJ 2016;355:i5834. Commento di un articolo (The Promise and Peril of Precision Medicine:
Phenotyping Still Matters Most. Mayo Clin Proc 216;91:1606) che riporta un errore interpretativo di un test genetico in una famiglia con figlio di 13 anni morto improvvisamente nel sonno con importati ricadute negative. All’autopsia trovati segni di miocardiopatia imprecisabile con dilatazione cardiaca, ma non è stato eseguito alcun test genetico. Sottoposti i genitori ed il fratello ad una valutazione cardiologica, negativa; ma il monitoraggio prolungato del fratello ha identificato un breve episodio di tachicardia parossistica sopraventricolare che è stata interpretata come tachicardia ventricolare non sostenuta. Proposta la diagnosi di Sindrome QT lungo anche per quanto successo nel fratello e sottoposto ad impianto di defibrillatore. In seguito (!!) eseguito un test genetico commerciale con identificazione di una variante di sequenza (missenso) del gene KCNQ1 che il laboratorio ha definito come “probabilmente patogena”. Da qui la diagnosi di s. LQT1 e la ricerca della variante nei membri della famiglia paterna, trovata in molti di loro, che sono stati quindi considerati affetti dalla stessa condizione. A questo punto i genitori ed altri membri della famiglia si sono rivolti per una seconda opinione alla Mayo Clinic dove viene messa in dubbio la diagnosi per l’assenza di sintomatologia nei portatori e la negatività dei relativi ECG. In più la variante trovata è sì rara ma non risulta avere le caratteristiche di una variante con perdita di funzione. Quindi hanno eseguito la ricerca della variante di KCNQ1 su sangue su carta bibula del fratello deceduto (finalmente! Ndr) risultata negativa. WES ha individuato invece, dopo varie ipotesi di trasmissione e una lunga selezione di varianti, una variante missenso de novo del gene DES causa di una cardiomiopatia dilatativa, compatibile con il quadro autoptico.
Lezioni: 1. test genetico all’affetto e non a coloro a rischio, 2. l’anatomo-patologo nei casi di morte improvvisa si preoccupi di conservare appropriatamente (ad es. congelare, ndr) tessuto cardiaco e sangue per future analisi, 3. i curanti non basino le loro conclusioni sul referto di test commerciali (la risposta deve essere l’esito di una collaborazione tra laboratorio e clinico che si occupa del caso, ndr), ma “do your own homework” e quindi valutino se quanto risulta dal referto è compatibile con quanto clinicamente osservato, in questo caso infatti tutti i portatori della variante di KCNQ1 erano clinicamente e con ECG normale.

A whole-genome analysis framework for effective identification of pathogenic regulatory variants in Mendelian disease. AJHG 2016;99:595 (citato da Nature Review Genetics October 2016). Genomiser è un nuovo sistema di analisi per l’interpretazione delle varianti non codificanti, aspetto che costituisce il principale ostacolo all’applicazione di WGS in diagnostica clinica nelle malattie mendeliane. In più aiuta anche ad associare varianti regolatorie a specifiche malattie mendeliane.

Early somatic mosaicism is a rare cause of long-QT syndrome. PNAS 2016;113:11555. Come sappiamo il mosaicismo (ndr, buona la definizione: “genetic variation within an individual that arises from errors in DNA replication during early development) sta assumendo sempre più rilevanza come causa di malattia genetica in moltissime condizioni, oltre al cancro. Ma conosciamo ancora poco dell’entità di eterogeneità cellulare in grado di produrre malattia e pochi sono gli strumenti diagnostici per identificarla.
(Caso clinico molto istruttivo, ndr): femmina quasi a termine con blocco AV 2:1, cesareo in 36sg. A 1 ora blocco AV 2:1 intermittente con molti episodi di torsades de pointes con QT di 542 ms. Impiantato un defibrillatore/cardiovertitore ed eseguita una ganglionectomia dello stellato bilaterale. A 6 mesi miocardiopatia dilatativa, trapianto cardiaco ortotopico (espiantato il cuore della pz e impiantato quello del donatore). Per diagnosi ricorso al pannello commerciale di geni LQTS (a 1 giorno) e al WGS (a 3gg) con risposta rapida. In 10a giornata (quindi se non ho capito male dopo 7 gg! Ndr) trovata una mutazione missenso in SCN5A ma con variante presente nella pipeline rapida ed assente in altre due pipeline, quindi tenui segni di mosaicismo (23.5%), variante assente con il Sanger nel campione di sangue. Ma il sospetto di mosaicismo ha indotto ad applicare WES al trio che ha individuato solo nella probanda una proporzione di alleli mutati del 7.5%. Nell’analisi genetica condotta su singole cellule ematiche la variante è stata isolata in 3 su 36 cellule, con conferma Sanger. Dall’analisi genetica con NGS di cellule derivate dai 3 foglietti embrionali (mesoderma su sangue, endoderma su urina e saliva, ed ectoderma su saliva) trovato che l’allele mutato è presente nel 7.9-14.8% delle letture di alta qualità. Quindi la presenza della mutazione in tutte tre i foglietti embrionali fa pensare che la mutazione si sia prodotta nel corso delle divisioni cellulari blastocistiche prima della gastrulazione e che non riguardi solo le cellule ematopoietiche. Infatti il sequenziamento di RNA di tessuto cardiaco (al momento del trapianto) ha indicato un’espressione dell’allele mutato nel 5.4-11.8% dei trascritti. Infine applicando un modello computazionale di elettrofisiologia cardiaca si dimostra definitivamente che il mosaicismo del tessuto di conduzione del miocardio è legato alla patologia aritmica. Per valutarne la frequenza nei disturbi aritmici sono stati cercati segni di mosaicismo in campioni biologici di 7.500 soggetti testati da laboratori di genetica commerciali con una o più tecniche di NGS (>30 geni analizzati). In tutto 4 persone (0.05%), tra queste un bambino, hanno mostrato un apparente mosaicismo per uno dei geni LQTS. Calcolando che nel 30% dei pz aritmici si riesce a trovare una mutazione causativa si può stimare che la prevalenza del mosaicismo nei casi non diagnosticati sia di0.17%. Sono state trovati anche altri 3 soggetti con mutazione patogena in mosaico di un gene LQTS in famiglie indagate per parente affetto e considerate quindi come fondatori. Questo conferma che la mutazione somatica avvenuta precocemente nel corso dello sviluppo è rara ma è comunque una causa di ricorrenza di aritmia.
La prevalenza osservata (0.05%) è sicuramente una stima conservativa in quanto considera solo mutazioni che interessando tutti i tessuti avvengono nelle prime 4 divisioni postzigotiche e per accertare la possibilità di mosaicismo con effetto clinico avvenuto in fasi più tardive occorrono analisi del DNA di tessuti affetti o da DNA libero. Dal punto di vista diagnostico viene opportunamente segnalato che il ricorso al pannello commerciale di geni LQTS è risultato negativo (in genere le mutazioni somatiche non vengono riportate nei pannelli commerciali) e che il 23.5% delle letture con la variante costituivano in questo caso un’indicazione per la presenza di un mosaico, con Sanger negativo. Quindi NGS è il mezzo più efficace per identificare un mosaicismo, soprattutto se si ricorre a tecniche con alto numero di letture. Importante raccomandazione: applicare, anche per individuare mosaicismi, nei neonati con malattia da causa non nota che mette a rischio la vita o con sospetto di malattia genetica WES o WGS invece di usare il pannello di geni standard (della patologia principale, ndr)(lavoro eccellente utile ad indicarci come applicare le nuove tecniche genetiche diagnostiche e l’attenzione che si deve porre nella lettura e nell’interpretazione dei risultati, non solo per le malattie cardiovascolari; ndr).

Genetic reckoning. Nature 2016;538:140. Editoriale su un importante aspetto della nostra attività, che è la necessità di riverificare la patogeneticità che è stata attribuita, soprattutto applicando NGS, alle varianti trovate. Da uno studio pubblicato sullo stesso fascicolo (Deadly mutations in a new light. Pg. 154) si è riscontrato che in ExAC (Exome Aggregation Consortium), il maggior catalogo delle variazioni esoniche, molte varianti sono state erroneamente classificate come patogene. Risulta che in media ogni persona ha 54 varianti attualmente classificabili come patogene, anche se 41 di queste sono così comuni nella popolazione umana che è del tutto improbabile che siano associate a gravi malattie. Quindi va fatta una attenta valutazione della situazione ricorrendo anche a nuovi criteri valutativi. Viene portato un esempio di un noto genetista medico che ha individuato per diagnosi in un pz una variante legata inaspettatamente all’insufficienza renale riportata troppo frequentemente in EsAC per essere patogena. Per approfondire ha rintracciato da uno studio pubblicato (ClinSeq) a cui aveva partecipato altri 5 portatori della stessa variante proponendosi di verificare in loro la funzione renale. Molto bello ma non realizzabile su larga scala. Occorrono quindi database con dati genetici correlabili a cartelle cliniche in dettaglio della persona, come potrebbero essere la US president’s Precision Medicine Initiative (previsti dati di almeno 1 milione di americani) e UK 100,000 Genomes Project. Quanto trovato in questo lavoro comunque indica cautela interpretativa. Nelle analisi genetiche per identificare la causa delle malattie si è passati dagli studi di ampie famiglie in cui la patologia ricorreva generazione dopo generazione ad analisi mutazionali di popolazioni selezionate per patologia trascurando la popolazione normale. E questo ha portato ad attribuire erroneamente a molte delle varianti trovate un significato patologico, con conseguenze reali per i pazienti.
(Conclusione un po' scontata, ndr): quando si trova una variante che si sospetta legata ad una malattia verificarne prima la frequenza in database come ExAC e, soprattutto prima di concludere che è patogena, verificare se può avere un ruolo funzionale nella malattia. “Let the reckoning begin” (a braccio, riprendiamo da capo, ndr).

Deep sequencing of 10,000 human genomes. PNAS 2016;113:11901. Craig Venter e il gruppo del suo istituto presenta una buona notizia per la genetica umana e clinica: sulla base del sequenziamento di oltre 10.000 genomi umani con una copertura di 30x-40x per stabilire la qualità dei risultati e dell’individuazione di nuove varianti si rileva che il sequenziamento dell’84% del genoma di una persona è di buona qualità e che queste regioni includono il 91.5% delle sequenze esoniche e coprono il 95.2% delle sedi delle varianti patogene che conosciamo. In base alla distribuzione delle varianti sono state identificati alcune sedi intolleranti alla variazione, in sedi in cui più frequentemente sono localizzate le mutazioni patogene che conosciamo. Questi risultati quindi fanno concludere che le comuni piattaforme ora usate sono qualitativamente idonee per l’applicazione in campo clinico.

Prenatal and pre-implantation genetic diagnosis. Nature Reviwes Genetics 2016;17:643. Le malattie genetiche sono numerose (>4.600 fenotipi OMIM) e frequenti: ognuno di noi è portatore di alleli che in omozigosi sono causa di malattia, lo 0.17% della popolazione è portatore di una traslocazione  cromosomica apparentemente bilanciata che spesso causa infertilità o aborto o malformazioni congenite nei figli e, per l’età materna al concepimento in crescita in tutto il mondo occidentale, sta aumentando di conseguenza nei concepiti anche il rischio di anomalie cromosomiche di numero. In questa Perspective vengono presentate tutte le tecniche applicabili per la diagnosi/screening genetico prenatale e preimpianto e lo stato dell’arte, specificandone le attuali potenzialità e limitazioni, delle nuove tecniche del presente-prossimo futuro costituite dall’analisi dell’intero genoma della singola cellula e del cfDNA (cell free) fetale recentemente introdotto nella pratica ostetrica. Viene accuratamente presentata la storia della diagnosi prenatale, partendo da lontano (1966), con il bandeggiamento cromosomico degli anni ’70 che l’ha resa più precisa, la prima diagnosi preimpianto con selezione nel 1992 (Fibrosi cistica), la prima diagnosi di esclusione di trasmissione del gene mutato paterno su plasma materno nel 2002, l’identificazione di CNV con aCGH nel 2005 e nel 2006 lo screening genomico su singola cellula sempre con aCGH fino ai giorni nostri (Fig. 1, da lezione, ndr). Particolarmente utile l’aggiornamento su un tema molto caldo: l’introduzione di WES in diagnosi prenatale; sul feto studi retrospettivi dicono che sarebbe molto utile, in corso uno studio prospettico, ma come sappiamo ci sono molte difficoltà da superare. In teoria la tecnica non invasiva NIPT potrebbe essere l’‘holy grail’ (l’obiettivo finale ma sfuggente di una ricerca, ndr), tecnica in cui si sta provando lo screening delle microdelezioni, che però è ancora in valutazione per i valori predittivi positivi e negativi troppo bassi; ma per l’applicazione di WES siamo ancora più lontani. Viene presentata la storia della diagnosi genetica preimpianto (prima applicazione nell’uomo nel 1990) e l’evoluzione. Vedi poi la Tab. 1 in cui vengono presentate le varie tecniche per identificare le differenti anomalie genetiche e cosa per ora è possibile fare usando materiale biologico ottenuto da tecniche invasive (CVS o AF) e da cfDNA. Se gli studi in corso (proof-of-concept) confermeranno la fattibilità della ricerca di aneuploidie genome-wide l’esame potrebbe entrare rapidamente nella pratica clinica di tutte le fecondazioni assistite. Una parte della Perspective è anche dedicata alla diagnosi e allo screening preimpianto. In Tab. 2 elencate le varie anomalie identificabili e le relative tecniche usando la metodologia dell’amplificazione dell’intero genoma. Alla fine gli aspetti etici futuri ma anche attuali con ad es. il ricorso all’impiego routinario di aCGH in NIPT per il rischio di trovare CNV di significato incerto o a bassa penetranza. Tutto questo porterà a cambiare considerevolmente la pratica clinica prenatale con un nuovo counseling genetico e nuovi approcci medici prenatali (con il ricorso ai vari “….oma”).

Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. PNAS 2016;113:11907 (molti AA cinesi, ndr). Lo screening cromosomico preimpianto (PGS) si applica per selezionare embrioni ottenuti in vitro individuando per l’impianto quelli senza anomalie cromosomiche. Ma la tecnica di biopsia ed analisi citogenetica è tecnicamente impegnativa e non priva di rischi immediati per il prodotto del concepimento ed anche perché non se ne conoscono gli effetti a distanza. E’ quindi opportuna la ricerca di vie alternative non invasive, anche perché alcuni studi (alcuni di italiani) indicano la presenza di DNA embrionale nel fluido bastocistico su cui sono stati anche analizzati i cromosomi e la presenza di DNA genomico e mitocondriale nel terreno di coltura dell’embrione. In questo studio si conferma che è possibile applicare lo screening cromosomico non invasivo (NICS) ricorrendo all’analisi del DNA genomico presente nel liquido di coltura e quindi evitare la procedura invasiva. Dopo aver validato sperimentalmente la tecnica ricorrendo alla amplificazione dell’intero genoma con MALBAC ed all’analisi con NGS si è sperimentato NICS in sette embrioni ottenuti da fecondazione in vitro di coppie con anomalie di struttura cromosomica (2 traslocazione bilanciata, 1 inversione), azoospermia (uno con 47,XXY), aborti ricorrenti (1), insuccesso ricorrente di impianto (1). In 6 si è ottenuta con successo la gravidanza clinica e in 4 vi è stata la nascita di un bambino sano, in 1 la gravidanza è ancora in corso (per l’unico embrione non sopravvissuto la motivazione al NICS era di traslocazione). Il metodo applicato per la sua elevata accuratezza e per la sua noninvasività costituisce una valida alternativa alla biopsia embrionale nelle fecondazioni in vitro.


MALATTIE NEUROLOGICHE/NEUROMUSCOLARI/NEURODEGENERATIVE/ PSICHIATRICHE
Classifying change and heterogeneity in amyotrophic lateral Sclerosis. Lancet Neurology 2016;15:1111 (Autore italiano). Commento di una Personal View sullo stesso fascicolo (Amyotrophic lateral sclerosis: moving towards a new classifi cation system. Pg. 1182)(tra gli AA anche un neurologo e ricercatore italiano) sulla necessità per la ALS di un aggiornamento dei criteri diagnostici rispetto alla classificazione di 15 anni fa (criteri El Escorial, successivamente rivisti – criteri Airlie House e Awaji-Shima), malattia per la quale non ci sono certi test diagnostici né biomarcatori e la cui diagnosi si basa sulla clinica e sui risultati dell’EMG dopo avere escluso condizioni simili. Il termine ALS comprende più condizioni e viene sostituito in alcuni paesi (UK ad es.) con Malattia del motoneurone. Non è chiaro se i fenotipi chiamati Atrofia muscolare progressiva e Sclerosi primaria laterale siano parte della ALS o vadano considerati come condizioni autonome. Analogamente le Paralisi bulbare o psuedobulbare talora vengono distinte dalla ALS anche se potrebbero far parte dello spettro fenotipico della ALS. Lo stesso, in presenza di deficit cognitivo, tra ALS e Demenza fronto-temporale (in Fig. 1 si specificano i principali segni clinici di queste condizioni). L’articolo auspica il concorso di più tecniche, da quelle molecolari alle neuroimmagini e a biomarcatori che insieme potranno chiarire meglio i vari fenotipi e consentire una diagnosi precoce di questa malattia che è più frequente di quanto ritenuto (>3:100,000 persone), con età di comparsa più avanti negli anni rispetto a quanto noto e con rapporto tra maschi e femmine affetti simile.

Sclerosi Laterale Amiotrofica (ALS): la più comune causa di ALS e Demenza Fronto-temporale è l’espansione esanucleotidica GGGGCC nel primo introne di C9ORF72 che genera dipeptidi tossici. Ne viene studiato il meccanismo patogenetico.
C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less
Organelles. Cell 2016;167:774.
Toxic PR Poly-Dipeptides Encoded by the C9orf72 Repeat Expansion Target LC Domain Polymers. Cell 2016;167:789.

Calpain 1 in neurodegeneration: a therapeutic target? Lancet Neurology 2016;15:1118. Lettera alla rivista in cui AA che hanno segnalato pz con Paraplegia Spastica 76 (MIM #616907), una rara malattia AR da mutazioni inattivanti il gene CAPN1 (Calpaina 1) che compare sui 20-30 anni, propongono un meccanismo patogenetico di funzione neuroprotettiva, anche sulla base di studi nei modelli animali, del prodotto di tale gene. D’altra parte però ci sono studi nell’uomo e in modelli animali da quali risulta che l’inibizione delle calpaine, inclusa la 1, ha un effetto neuroprotettivo in alcune patologie neurologiche quali il trauma cranico e l’Alzheimer facendo pensare ad un ruolo dell’iperattivazione di questi enzimi nella patogenesi di tali e suggerire un effetto terapeutico ricorrendo a loro inibitori (ClinicalTrials.gov, NCT02220738, terminata la fase 1). L’ipotesi allora potrebbe essere che la Calpaina 1 abbia effetti neuroprotettivi a livelli normali e che sue modificazioni in eccesso o in difetto comportano segni neurologici. Ma potrebbe anche essere che la sovrattivazione della Calpaina 1 nel trauma cranico e nell’Alzheimer sia una risposta al danno, non la causa. Necessari ulteriori studi con il ricorso a studi in vitro su neuroni umani da cellule staminali totipotenti indotte per verificare l’utilità del ricorso all’inibizione della Calpaina 1 per attivare l’effetto neuroprotettivo in queste due patologie.

Mutations associated with familial Parkinson’s disease alter the initiation and amplification steps of
α-synuclein aggregation. PNAS 2016;113:10328. L’α-Sinucleina (SNCA), proteina espressa abbondantemente nell’encefalo soprattutto a livello presinaptico, è il principale componente dei corpi Lewy, inclusioni intraneuronali tipiche del Parkinson e di altre malattie neurodegenerative tra cui la demenza con corpi Lewy. Mutazioni di α-Sinucleina sono presenti nel Parkinson familiare ad insorgenza sia precoce che tardiva. In questo lavoro in vitro vengono presentati i risultati ottenuti ricorrendo ad approcci sperimentali e teorici sull’effetto di mutazioni puntiformi su due tappe dell’aggregazione sinucleinica, ritenute importanti per lo sviluppo della malattia: la formazione inziale degli aggregati e la loro proliferazione.


Mutations in Human Accelerated Regions Disrupt Cognition and Social Behavior. Cell 2016;167:341. L’analisi comparativa genomica ha identificato loci che sono molto diversi tra la nostra specie e altre specie, loci che potrebbero essere associati ad alcune specifiche caratteristiche umane come la socializzazione e gli aspetti cognitivi. In queste regioni (Human Accelerated Regions) sono particolarmente frequenti CNV de novo associate all’autismo e viene stimato che mutazioni bialleliche di questi loci sono causa del 5% di autismo di pz con genitori consanguinei. Utilizzando varie tecniche e ricorrendo a topi transgenici gli AA hanno individuato mutazioni bialleliche candidate in HAR che interagiscono con promotori di alcuni geni del neurosviluppo tra cui CUX1, PTBP2, GPC4, and MEF2C, la cui alterata espressione è causa di difetti di sinaptogenesi o di altre anomalie di sviluppo. Questi potrebbero essere i meccanismi patogenetici di mutazioni in HAR.

TRiC subunits enhance BDNF axonal transport and rescue striatal atrophy in Huntington’s disease. PNAS 2016;113:E5655. Degeneration of the corticostriatal circuit is a key neuropathological and clinical feature of Huntington’s disease (HD).of the corticostriatal circuit is a key neuropathological and clinical feature of Huntington’s disease (HD). To define disease mechanisms and explore treatments, we recreated the corticostriatal circuit in microfluidic chambers using neurons from the BACHD mouse model of HD and WT controls. We showed that expression of mutant huntingtin (mHTT) induced defects in brain-derived neurotrophic factor (BDNF) transport in BACHD cortical axons that resulted in atrophy of striatal target neurons. Introducing subunits of the cytosolic chaperonin T-complex 1 (TCP-1) ring complex (TRiC) into BACHD cortical neurons reduced mHTT, rescued defects in BDNF transport, and normalized the size of striatal neurons. These findings encourage studies to explore a role for TRiC reagents as possible treatments for HD

GENETICA UMANA/CLINICA
***
and cognitive impairment. PNAS 2016;113:11289. Inizia con una frase che dovremmo sempre tenere presente quando proponiamo l’esoma per un pz con una malattia che crediamo mendeliana: “Despite major advances in Mendelian genetics, the role in normal human biology and the impact of mutation of >75%
of the 20,000 protein-coding genes in the human genome remain to be determined”. Va meglio quando c’è consanguineità, ovviamente. B. di 8 anni di origine turca figlio di secondi cugini. A 8 mesi vomito ritenuto da gastroenterite con aumento delle transaminasi rimaste però elevate con normale funzione epatica, deficit di vit. D. e perdita di grassi con le feci. Ecografia epatica normale, ma alla biopsia osservati segni di fibrosi e rigenerazione del fegato, non chiari segni di cirrosi. Normale sviluppo staturo-ponderale, lievemente ritardato lo sviluppo psico-motorio con segni di lieve disabilità intellettiva (Wechsler 66). Neurologicamente disartria e andatura lievemente atassica. Normale RM cerebrale. WES ha identificato una mutazione troncante di una ossidoreduttasi perossisomiale, AcilCoA ossidasi 2 (ACOX2) del pathway della biosintesi degli acidi biliari. Una patologia da tenere presente nel caso di malattia cronica epatica e/o cirrosi da causa non nota anche perché potenzialmente trattabile con acidi biliari esogeni impedendo così la produzione di metaboliti epatotossici.

***
Angelman syndrome — insights into a rare neurogenetic disorder. Nature Reviews Neurology 2016;12:584. Review su questa rara ma ben nota malattia neurologica da perdita di funzione del gene UBE3A da varie cause come mutazione o microdelezione dell’allele materno (a cui è associato un fenotipo più grave probabilmente per delezione anche di altri geni come quelli del recettore GABA), disomia uniparentale paterna o difetto di imprinting. In Tab. 1 la frequenza ed il rischio di ricorrenza delle varie genetiche, da cui risulta un alto rischio per le mutazioni e per i difetti di imprinting.
Il meccanismo patogenetico sembra costituito dalla inibizione della formazione delle sinapsi e del rimodellamento sinaptico esperienza-dipendente. La terapia per ora consiste solo nel controllo delle crisi convulsive, ma vi sono state sperimentazioni animali e cliniche per tentare di attivare il secondo allele paterno, senza successo. Nel 2017-2018 è in programma una sperimentazione clinica in fase 1 con il ricorso ad un oligonucleotide antisenso per tentare di attivare l’allele inattivo paterno per via intratecale. Gli studi sugli animali ci dicono però che se si può avere un certo effetto clinico è necessario applicare la terapia molto precocemente. In ogni modo la ricerca di queste malattie rare sarà sempre più attiva grazie ad iniziative multicentriche come European Network for Human Congenital Imprinting Disorders (EUCID.net) fondato nel 2013 che ha collaborazioni con centri USA, giapponesi, basiliani, canadesi ed australiani. E molto attiva è anche la partecipazione con contributi economici per la ricerca da parte delle varie fondazioni internazionali, tra cui la Nina Foundation olandese, parte della Angelman Syndrome Alliance e la Angelman Syndrome Foundation  americana (e questo è il messaggio da dare alle famiglie, ndr).

Rett Syndrome and the Ongoing Legacy of Close Clinical Observation. Cell 2016;167:293. L’abstract dice: nel cinquantesimo dalla pubblicazione da parte di Andreas Rett (Rett, A. Wien. Med. Wochenschr. 1966;116:723) di 22 ragazze con una patologia neurologica cinicamente distinguibile ne vengono presentati i progressi fatti nella comprensione dei meccanismi patogenetici e nello sviluppo di possibili terapie oltre a sottolineare il contributo che l’ampia ricerca fatta in questa sindrome ha portato nel campo della neurobiologia e nella genetica delle malattie neurologiche. Storia (“A Peculiar Brain Atrophic Syndrome’’). Fenotipi e storia naturale. Storia della genetica della Rett (“going fishing”). Neurobiologia delle malattie da MECP2 nell’uomo e nel modello animale (perché la sintomatologia non è congenita? perché quella sequenza di segni clinici, perché si può avere anche nel modello murino adulto c’è questo tempo di latenza?). Prospettive future, soprattutto per la terapia non facile perché la perdita di MECP2 altera la funzione di migliaia di geni e anche perché sono interessati buona parte dei neuroni e tutti i sistemi di neurotrasmissione Quindi la terapia ”will be no small feat (impresa)”. Infine tre interessanti considerazioni: 1. senza l’accurata descrizione clinica fatta da Rett e da Hagberg nel 1989 non avremmo pensato a una sindrome sporadica a base genetica; 2. la stretta collaborazione tra laboratorio e clinica e il gran numero di modelli animali ottenuti hanno consentito di verificare l’ampio spettro fenotipico da varianti di MECP2 e di iniziare a conoscere il ruolo dell’epigenetica nella neurobiologia; 3: la reversibilità dei segni clinici nei modelli animali fa ben sperare nel successo di futuri interventi terapeutici nell’uomo.

Genomics is failing on diversity. Nature 2016;538:161. Dal sottotitolo “some populations are still being left behind on the road to precision medicine”. Già nel 2009 si era constatato che il 96% dei partecipanti a studi di associazione genome-wide (GWAS) era di discendenza europea. Ora i non europei sono il 20%, ma buona parte di loro sono di origine asiatica o asiatici, con proporzioni del tutto trascurabili per nativi americani o australiani, ispanici o latino-americani (vedi Figura). Nonostante le raccomandazioni di NJH fatte 20 anni fa di includere negli studi genetici di popolazione vari gruppi etnici i fondi stessi di NIH e di altra provenienza continuano a trascurare vari gruppi etnici. Interessante l’analisi dei perché, che sono organizzativi (più popolazioni includi nello studio più variabili da controllare, più conveniente usare coorti già disponibili come Framingham Heart Study), condivisione di stesse condizioni ambientali, sanitarie come accessibilità a centri medici, ma anche storiche e culturali, come la non disponibilità a dare informazioni o campioni biologici per progetti di ricerca. Cosa si perde: l’identificazione di nuove varianti o di varianti rare che contribuiscono alle malattie complesse, quindi la miglior comprensione della loro base biologica. Ne vengono fatti esempi. Una distorsione nell’accertamento avviene anche negli studi di sequenziamento con WES o WGS. Ma oltre ad ostacolare la comprensione dei meccanismi biologici delle malattie complesse ha impatto anche in campo medico nell’interpretazione quando applicate per diagnosi nelle popolazioni poco studiate come quelle di origine africana. Che fare? Favorire con finanziamenti studi multietnici, ma sono necessari anche cambiamenti culturali, anche inclusivi delle diverse etnie. Così sarà possibile far entrare la medicina di precisone nella pratica clinica.

Mitochondrial dysfunction could precipitate motor neuron loss in spinal muscular atrophy. Nature Reviews Neurology October 2016. In questa Research Highlight viene commentato il risultato di uno studio in un nuovo modello murino di SMA da cui risulta che la disfunzione mitocondriale con il conseguente difetto di produzione energetica potrebbe essere la causa della morte dei motoneuroni (Hum Molec Genet 2016;25:3395).

Why Cockayne syndrome patients do not get cancer despite their DNA repair deficiency. PNAS 2016;113:10151. Perché la CS non è associata al cancro, come lo Xeroderma Pigmentoso che come CS è dovuta a mutazioni di geni del pathway della riparazione con escissione di nucleotidi (NER). L’analisi in vitro di cellule di pz con CS dimostra che il difetto di riparazione accoppiata alla trascrizione (TCR) aumenta la citotossicità ma non è mutagena. Quindi il non aumento di patologia neoplastica nei pz CS, in cui l’aspettativa di vita è di 12 anni, è dovuto alla mancanza di mutagenesi indotta da UV, e non dalla precoce letalità.

The dark side of the human genome. Nature 2016;538:275. Sottotitolo: Scientists are uncovering the hidden switches in our genome that dial gene expression up and down, but much work lies ahead to peel back the many layers of regulation. E, ancor più chiaro, “The human genome is not packed with ‘junk’ as previously thought, but with regulatory regions that modulate gene activity. Con il numero di geni stimati da 25.000 anni fa ai 19.000 di ora, che costituiscono solo l’1-2% dell’intero genoma e il resto (99%) “dark matter” e centinaia di migliaia di regioni funzionali che controllano l’espressione genica. In questa nota tecnica vengono precisate le tecniche che possono aiutarci a capire, tra queste l’impiego di CRISPR-Cas9.

Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications. Nature 2016;538:265 (alcuni AA italiani). Il locus di SOX9, importante fattore di trascrizione per lo sviluppo, è in una regione genomica coinvolta in alcune patologie genetiche con ampia variabilità fenotipica dello sviluppo sessuale e scheletrico. In questo lavoro si analizza in che modo le duplicazioni genomiche in questa regione interessano la struttura cromatinica di ordine superiore, in particolare domini topologicamente associati (TAD), uno contenente SOX9 (SOX9 TAD) ed un secondo che contiene due canali del potassio KCNJ2 e KCNJ16 (KCNJ TAD). Il primo dominio, considerato un deserto genico, contiene molti elementi regolatori e sedi mutazionali causa di malattie, con duplicazioni che a seconda della loro dimensione e localizzazione danno luogo a condizioni come l’inversione sessuale o la s. Cooks. In questo studio si è voluto analizzare le differenze delle duplicazioni associate o non associate all’inversione sessuale in fibroblasti di pz e di controlli ricorrendo alla chromosome conformation capture con high-throughput sequencing (4C-seq) e a topi geneticamente modificati. Le duplicazioni comportano la formazione di nuovi domini cromatinici (neo-TAD) che determinano la patologia molecolare. I risultati fanno ritenere i TAD delle unità di regolazione genica con una stabilità interna che può essere modificata da varianti di struttura geneomica. Gli AA suggeriscono che la metodologia applicata può aiutare a prevedere l’esito fenotipico di CNV trovate nella routine diagnostica per malformazioni e/o disabilità intellettiva.

Biallelic hypomorphic mutations in a linear deubiquitinase define otulipenia, an early-onset autoinflammatory disease. PNAS 2016;113:10127. Mutazioni di geni dell’immunità innata sono causa di malattie autoinfiammatorie sistemiche. Sono state studiate con l’esoma e screening del gene candidato famiglie di consanguinei (2 famiglie turche, ciascuna con un affetto, e un’ampia famiglia pachistana con 3 affetti) con componenti affetti da una malattia autoinfiammatoria con febbre, esantema cutaneo e pustole dalle prime settimane di vita, artralgia e rigonfiamenti articolari, diarrea, lipodistrofia e deficit di crescita. La terapia steroidea ha dato qualche effetto, ma è stata più efficace la terapia con inibitori di IL-1β (anakirna) o di TNF (infiximab). Risultati normali o aumentati i livelli di T, B e cellule natural killer, normali o aumentate le Ig. Identificata omozigosi con mutazioni (1 frame-shift e due missenso) con perdita di funzione del gene Otulin (MIM #617099), codificante una deubiquitinasi lineare che elimina l'ubiquitina, piccola proteina ubiquitaria che induce modificazioni post traduzionali di proteine regolando vari processi cellulari. Outiln è un regolatore di Wnt e dei complessi del sistema di segnale dell’immunità innata. Quanto descritto, oltre a quanto già noto per aploinsufficienza del gene A20 (MIM #191163), che è un altro gatekeeper (a braccio “custode”, ndr) dell’immunità innata, rende evidente lo spettro fenotipico di malattie genetiche da alterato pathway ubiquitinico con sopraregolazione di citochine suggerendo la possibilità di efficaci terapie che hanno come bersaglio la stessa citochina.

Mutations in mitochondrial enzyme GPT2 cause metabolic dysfunction and neurological disease with
developmental and progressive features. PNAS 2016;113:E5598. Studiate con GWAS due ampie famiglie di consanguinei con 14 membri affetti da una malattia neurologica caratterizzata da disabilità intellettiva, microcefalia di origine postnatale e paraplegia spastica variabile e progressiva. Identificato un locus strettamente associato in 16q. L’applicazione di WES ha consentito di individuare in omozigosi mutazioni inattivanti (una non senso e una missenso) la glutammato piruvato transaminasi 2 (GPT2)(MIM #616238. Mental retardation, autosomal recessive 49). Tale transaminasi regola importanti processi metabolici tra cui il metabolismo degli aminoacidi e il ciclo tricarbossilico (Krebs). Il glutammato poi è un substrato della sintesi del glutatione che è un antiossidante cellulare. GTP2 è localizzata nei mitocondri ed è particolarmente espressa nell’encefalo nelle prime fasi postnatali durante lo sviluppo dei circuiti cerebrali. Il topo con fenotipo nullo Gpt-2 ha ridotta crescita cerebrale e l’encefalo di topi mutanti ha anomalie del metabolismo aminoacidico, del ciclo di Krebs e dei meccanismi di neuroprotezione. GTP2 è quindi un importante enzima mitocondriale la cui carenza causa neurodegenerazione.

Geneticists should offer data to participants. Nature 2016;539:7. Singolare ed istruttiva esperienza di una ricercatrice di genetica umana che analizza DNA di migliaia di anonimi sconosciuti. Come sempre bisogna provare per capire: chiesta di partecipare come volontaria in una ricerca dando il proprio DNA per una ricerca le è stata negata la possibilità di conoscere i propri dati, perché questo non è previsto nelle ricerche biomediche e genetiche. Mentre questi dati sono disponibili in database con accesso limitato ai ricercatori (ironicamente incluso lei, ndr).

Retirement Study. PNAS 3 October 2016 :E6335. Sappiamo che l’accorciamento dei telomeri, strutture protettive della parte terminale dei cromosomi, sono un segnale di invecchiamento cellulare, che può essere dovuto a fattori genetici (ereditabilità 36-84%) ed anche da varianti di singolo gene, oltre a fattori ambientali come lo stress subito in età infantile o da adulto. In questo studio analizzando la lunghezza dei telomeri da cellule salivari (Telome Health www.telomehealth.com/) di 4.600 persone di età => 50 anni in rapporto a riferiti episodi di stress finanziario, traumatico o sociale nel corso dell’infanzia o in età adulta viene documentata una chiara relazione tra telomeri corti e numero di fattori stressanti subiti in gran parte nel corso dell’infanzia, con un incremento per ogni esperienza di stress, soprattutto sociale o traumatico, non finanziario, dell’11% di probabilità di avere ad età avanzata telomeri corti. Non c’è invece relazione tra lunghezza dei telomeri ed un singolo evento di stress (sapevamo che lo stress fa male, ma come scrive L. De Crescenzio su “I pensieri di Bellavista”: “Tra lo stress e la noia preferisco lo stress, ndr).

Knockout! Knockout! Who’s Not There? Cell 2016;167:289. Già, e chi non c’è? Commento di articoli già segnalati (Rare rewards. Nature 2016;536:249 Editoriale e Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Pg. 285 e A deep dive into genetic variation. Pg. 277)(vedi selezione articoli dell’Agosto 2016) in cui si sottolineano i risultati ottenuti dal Exome Aggregation Consortium (ExAC), da cui risulta un’inattesa ridondanza di geni nel nostro genoma di geni e un’ampia panoramica dei geni ritenuti essenziali, con anche suggerimenti di cautela nell’interpretazione delle varianti allo screening genomico mediante NGS.

An atlas of embryogenesis. Nature Review Genetics October 2016. Pubblicato l’atlante del trascrittoma dell’organogenesi umana che fornisce una mappa dell’espressione genica organo-specifica durante le tappe fondamentali dello sviluppo (Gerrard, D. T., Berry, A. A., et al. An integrative transcriptomic atlas of organogenesis in human embryos. eLife 2016;5:e15657).

The Structure of the Polycystic Kidney Disease Channel PKD2 in Lipid Nanodiscs. Cell 2016;167:763. La malattia policistica renale AD, una delle più comuni malattie monogeniche, è geneticamente eterogenenea con 4 geni noti, di cui 3 AD tra cui il gene PKD2 (OMIM). In questo lavoro su nanodisc (membrane false) vengono studiate le caratteristiche strutturali del canale ionico della malattia policistica renale 2 (PKD2), proteina di membrana multipasso (che attraversano il doppio strato fosfolipidico più volte e che funziona come un canale cationico permeabile al calcio) e viene documentato il modo in cui le mutazioni patogene alterano la struttura e la funzione del canale.In vitro functional studies of several selected variants showed that they either impaired transcription, reduced binding to the SNU13 (601304) gene, or interfered with processing of the SNORD118 precursor RNA, consistent with a loss-of-function effect. In vitro functional studies of several selected variants showed that they either impaired transcription, reduced binding to the SNU13 (601304) gene, or interfered with processing of the SNORD118 precursor RNA, consistent with a loss-of-function effect.
CLINICAL TRIALS
80% of China’s clinical trial data are fraudulent, investigation finds. BMJ 2016;355:i5396. Secondo una ricerca del Center for Food and Drug Inspection di China Food and Drug Administration (CFDA) in Cina i risultati della sperimentazione clinica di oltre dell’80% di 1.622 nuovi farmaci di cui è stata richiesta la registrazione al CFDA sono falsi o difettosi o inadeguati. Secondo un manager ospedaliero, di cui non viene fatto il nome, tutto questo era risaputo in ambito sanitario. Secondo lui in gran parte dei casi questo è dovuto alla competizione ed al desiderio delle compagnie farmaceutiche di partecipare al boom del mercato dei farmaci cinese (97 miliardi di €). Si sta pensando come fare per evitare tutto questo.

Is this trial misreported? Truth seeking in the burgeoning age of trial transparency. BMJ 2016;355:i5543. Sottotitolo: “One group’s efforts to monitor misreporting of outcomes has irritated several medical journals, which argue that the differences discovered are not clinically important. So how seriously should we be taking it?”. In breve: che succede in un’epoca di crescente richiesta di trasparenza sui risultati delle sperimentazioni a chi si mette a controllare la veridicità di pubblicazioni di risultati di sperimentazioni cliniche, come COMPare, e chiede che vengano pubblicate le correzioni? Viene osteggiato dagli editori delle riviste. Uno spaccato impressionante con un primo esempio dei primi anni 2.000 della paroxetina, un farmaco antidepressivo (inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina, vedi Spigolature Ottobre 2016), in cui la casa farmaceutica faceva dire ai suoi agenti di vendita che la pubblicazione su una rivista con peer review dei dati della sperimentazione era un “landmark study … demonstrates REMARKABLE efficacy and safety”. Ma le cose non erano proprio così perché “trial authors selectively present trial results leading, almost inevitably, to a rosier picture than would have occurred had the trial been reported according to the original protocol”. Lo scenario è poi risultato impressionante quanto nel 2015 ha iniziato la sua attività COMPare: di 67 sperimentazioni pubblicate sulle principali riviste internazionali (incluso BML, NEJM, Lancet, JAMA ecc.) solo 9 riportavano i dati sugli outcome specificati nel programma sperimentale, mentre le altre 58 hanno sostituito gli outcome indicati con altri. Poche delle 58 lettere all’Editore che segnalavano quanto trovato hanno portato ad una segnalazione di correzione. Vengono riportati commenti dei vari editori su queste lettere, chi ha rifiutato e chi invece ne ha accetto alcune. Ma alla fine qualcuno riconosce che “Watchdog groups like COMPare play an important role in educating the public and motivating journals and authors to do better”.

Nearly half of all trials run by major sponsors in past decade are unpublished. BMJ 2016;355:i5955.TrialsTracker, un nuovo sistema automatico sviluppato da ricercatori dell’Università Oxford per far luce sull’attività delle industrie farmaceutiche ed università, ha trovato che negli ultimi 10 anni il 65% (285) di sperimentazioni cliniche della Sanofi non sono mai state pubblicate, (201, 37.6%) Novartis Pharmaceuticals, (194, 34.8%) US National Cancer Institute, (186, 63.7%) Assistance Publique-Hôpitaux de Paris e (183, 22.6%) GlaxoSmithKline. Uno sponsor —Ranbaxy Laboratories Limited indiana, non ha mai pubblicato nello stesso periodo alcun risultato delle 96 sperimentazioni. All’altro estremo c’è una compagnia farmaceutica irlandese che ha pubblicato i risultati di tutte le 96 sperimentazioni condotte. Buono il suggerimento conclusivo di uno degli universitari che ha sviluppato TrialsTracker “If any institution is concerned that it is doing badly in our league tables (classifica), then there is one simple thing they can do: publish their trial results, using their trial registry number, so that this information can be accessed and read by doctors, researchers, and patients”.

CONSORT 2010 statement: extension to randomised pilot and feasibility trials. BMJ 2016;355:i5239. Linee guida per migliorare la trasparenza e la qualità delle pubblicazioni di sperimentazioni controllate randomizzate (Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT) statement).

European drug agency launches website giving open access to trial data. BMJ 2016;355:i5700. EMA ha preparato un sito web per accedere ai dati clinici dei farmaci presentati per le sperimentazioni cliniche. Iniziativa che ha richiesto 4 anni per essere realizzata, anche per questioni legali poste da due industrie farmaceutiche che non vogliono la pubblicazione dei dati clinici. Accesso che favorirà la trasparenza delle procedure e porterà benefici e considerazione per l’accademia e la pratica medica. La consultazione dei dati clinici è aperta a tutti, le pagine sono a “prova di copia e incolla”. A regime verranno inseriti nel sito dopo 60 giorni dalla presentazione della domanda di autorizzazione o entro 150 giorni da quando il richiedente chiede di ritirare la propria domanda.

Big win possible for Ionis/Biogen antisense drug in muscular atrophy. Nature Biotechnology 2016:34:1002. Il 1 Agosto 2016 annunciato il successo di un farmaco antisenso Nusinersen (oligonucleotide antisenso che riattiva con un meccanismo di splicing il gene backup SMN2) nella terapia della SMA (vedi Articoli interesse Settembre 2016: Splicing solutions: Companies explore new techniques to fix splicing errors. Nature 2016;22:967). Il farmaco era in sperimentazione clinica in fase 3 per verificare i miglioramenti dell’attività motoria a tal punto che era già stato anticipato che nella sperimentazione non vi sarà sarebbe stato più il gruppo del placebo. Ora nel 2017 la FDA l’ha approvato.

Muscular dystrophy drug looks set for commercial success despite clinical doubts. Duchenne 2016;355:i5346. Etepliresen (Exondys 51) della Sarepta Therapeutics per correggere gli errori di splicing, è stato in sperimentazione per gli ultimi 4 anni per la cura del Duchenne ed i cui risultati sono stati recentemente inviati alla FDA per l’approvazione, che ha ora concluso così: “the main clinical study on which it rests should probably be retracted by its authors”, ma dopo ampio dibattito e pareri contrastanti nella commisisone scientifica, ha approvato. Il Farmaco il cui costo è di 270.000 €/a, è prescritto dalla maggior parte dei neurologi americani, ma comunque è applicabile solo per pz con una certa mutazione (13% dei pz Duchenne). L’approvazione è dovuta al presidente del Center for Drug Evaluation and Research della FDA perché la sua mancata accettazione avrebbe comportato la rinuncia, per questioni economiche, dell’azienda farmaceutica ad ulteriori sperimentazioni cliniche e perché comunque la FDA deve essere dalla parte dei pazienti.
Sufficient trial size to inform clinical practice. PNAS 2016;113:10518.

Splicing solutions: Companies explore new techniques to fix splicing errors. Nature 2016;22:967

TERAPIA FARMACOLOGICA/GENICA E GENE EDITING
CRISPR concerns. Nature 2016;538:17. In un rapporto preliminare di 130 pag. del 30 Settembre 2016 il Nuffield Council on Bioethics di Londra ha precisato che le due nuove applicazioni tecniche resesi disponibili, l’editing genomico degli embrioni umani e degli animali di allevamento, richiedono ulteriori approfondimenti. Si riconosce che anche se è prevedibile che ci vorranno anni prima che venga introdotto nelle procedure della riproduzione umana, se ne stanno discutendo gli aspetti etici da molti soggetti e in molte sedi. Come The US National Academies of Sciences, Engineering and Medicine USA (è in programma un documento sul genome editing nell’uomo nei primi del 2107) e in Europa un gruppo indipendente di eticisti per la istituzione di una commissione europea per garantire che i metodi CRISPR siano applicati in medicina in modo appropriato e sicuro. E questo riguarda gli aspetti medici e condizioni rare come le malattie genetiche, ma da parte della stampa non scientifica c’è anche l’idea che la tecnica possa essere usata anche per migliorare il livello cognitivo delle persone.
L’altro aspetto che viene considerato è l’applicazione negli animali di allevamento e di come etichettare i relativi prodotti rendendoli tracciabili prima di metterli sul mercato. L’applicazione in questo caso è sicuramente molto più ravvicinata, infatti sono già in corso studi per ottenere bestiame senza corna o maiali resistenti alle malattie più comuni, ma di questo si parla poco.

Genome editing using CRISPR-Cas9 to create the HPFH genotype in HSPCs: An approach for treating sickle cell disease and β-thalassemia. PNAS 2016;113:10661. E’ noto da tempo che persone con persistenza ereditaria di Hb fetale (HPFH), da delezione o SNV di regioni del locus β-globinico che regolano la trascrizione e che hanno un’elevata espressione permanente della Hb fetale, e che hanno anche mutazioni della subunità β del gene emoglobinico causa di due differenti malattie (Falcemia, β-talassemia), hanno una sintomatologia clinica della talassemia o della falcemia attenuata.
L’impiego dell’editing genomico CRISPR con mutazione provocata nei promotori di GBG1 e HBG2, che simula quanto avviene nella HPFH, nelle cellule progenitrici dei globuli rossi, ha portato in vitro ad un aumento dei valori di HbF in queste cellule a tale punto da inibire l’ipossia causata dall’anomala morfologia eritrocitaria (A genome-editing strategy to treat β-hemoglobinopathies that recapitulates a mutation associated with a benign genetic condition. Nature Medicine 2016;22:987)(vedi selezione articoli Settembre 2016). In questo lavoro sempre in vitro tramite un editing genomico del locus β-globinico si è provocato su cellule staminali ematopoietiche una delezione di 13 Kb per simulare ciò che avviene nella HPFH. Si dimostra che vengono prodotti globuli rossi con alti livelli di HbF sufficienti per inibire nella Falcemia le anomalie morfologiche indotte dall’ipossia in queste cellule. Quindi una conferma, da parte di un altro gruppo, della applicabilità di tale tecnica per il trattamento di due gravi malattie, particolarmente diffuse in alcune nazioni e gruppi etnici.

MODELLI ANIMALI/IN VITRO
Humanized H19/Igf2 locus reveals diverged imprinting mechanism between mouse and human and reflects Silver–Russell syndrome phenotypes. PNAS 2016;113:10938 (molti AA italiani). Sappiamo che l’imprinting genomico è un meccanismo essenziale per lo sviluppo dei mammiferi e che le regioni di controllo dell’imprinting (ICR) differiscono da specie a specie. In questo lavoro si è voluto verificare il ruolo specie specifico dell’ICR del locus Igf2, la cui sregolazione nell’uomo è causa della s. Beckwith e della s. Silver-Russel, generando un topo in cui ICR umano (hIC1) ha sostituito quello murino (mIC1). Si dimostra che hIC1 può sostituire senza danni la funzione di mIC1sull’allele materno, mentre hIC1 causa una sregolazione funzionale del locus H19/Ihf2 sull’allele paterno determinando nel topo, quando trasmesso, deficit di crescita, alterata metilazione hIC1 e assenza di espressione di H19 e Igf2. Nelle cellule germinali maschili del topo knock-in, hIC1 non è completamente metilato (NB: l’ipometilazione di IC1 è l’epimutazione che si trova più frequentemente nei pz con s. Silver-Russel) e vi è un’amentata dimetilazione di H3K4me2 in Hic1, dimostrando che anomalie di modificazione istoniche a livello di hIC1 interferiscono con il processo metilativo di hIC1 durante lo sviluppo delle cellule germinali. Gli AA fanno presente che tale modello murino può essere utile per studiare sia la s. Beckwith quando hIC1 è di trasmissione materna e la s. Silver-Russel quando è di trasmissione paterna.

Mutant PFN1 causes ALS phenotypes and progressive motor neuron degeneration in mice by a gain
of toxicity. PNAS 2016:E6209. Mutazioni del gene Profilin 1 (PFN1) sono causa di una forma di Sclerosi Laterale Amiotrofica (ALS 18, MIM #614808), malattia neurodegenerativa con perdita di motoneuroni che comporta paralisi e morte. PFN1 promuove la polimerizzazione actinica e regola varie funzioni cellulari. In questo lavoro si è voluto favorire lo studio dei meccanismi patogenetici tramite modelli murini. Si è generato un topo transgenico portatore di una mutazione nota come causa di ALS che manifesta il classico fenotipo della ALS.

Elevated ERK/p90 ribosomal S6 kinase activity underlies audiogenic seizure susceptibility in fragile X mice. PNAS 2016;E6290. La s. FXS è dovuta a silenziamento trascrizionale o a mutazione di FMR1 la cui proteina (FMRP) lega >1.000 mRNA tra cui trascritti che codificano proteine essenziali per la funzione sinaptica reprimendo la loro traduzione tramite lo stallo del ribosoma. Il meccanismo patogenetico della sindrome consiste quindi nell’aumentata sintesi proteica. In questo lavoro si dimostra nel modello murino della FXS delle due principali molecole di segnale che regolano la sintesi proteica, ERK e mTOR, solo ERK risulta avere una elevata attività nelle neocorteccia che determina un’iperattivazione della chinasi RSK e un’iperfosforilazione della proteina ribosomiale S6. L’inbizione di RSK comporta nel modello murino la mancata comparsa delle tipiche convulsioni audiogeniche che sono l’equivalente dell’ipersensibilità sensoriale presente nei pz con FXS. Da qui un possibile target terapeutico per pz con la sindrome.

Adenosine A1 receptor antagonist rolofylline alleviates axonopathy caused by human Tau ΔK280. PNAS 2016;113:11597. Non è ancora chiaro come si produca la neurotossicità legata alla presenza di ammassi neurofibrillari di Tau che sono presenti in alcune malattie neurodegenerative. In questo studio in vitro e in topi Tau-transgenici si rileva che la Rolofillina, un antagonista del recettore dell’Adenosina A1, farmaco proposto per l’insufficienza cardiaca e renale, normalizza la funzione neuronale ed è in grado di normalizzare la funzione cognitiva nel topo transgenico. Un possibile suggerimento terapeutico.

Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism. PNAS 2016;113:E6496. Ricorrendo a modelli transgenici si è dimostrato un coinvolgimento degli oligodendrociti nel poco noto processo patogenetico della Sclerosi Laterale Amiotrofica. Ma non è stato possibile sinora dimostrare nei modelli in vitro o in vivo come partecipino a causare la morte dei motoneuroni. In questo studio si dimostra che gli oligodendrociti derivati da cellule staminali pluripotenti e da cellule progenitrici indotte di pz con ALS sporadica e familiare svolgono un ruolo attivo nella morte dei motoneuoni. La loro tossicità è mediata da fattori solubili e da contatto cellula-cellula, indicando possibili vie terapeutiche. Infatti il KO di SOD1 nelle cellule progenitrici oligodendrocitiche dei casi sporadici e familiari è in grado di evitare che si produca il danno neuronale in tutte le linee cellulari, ad eccezione di quelle con mutazione da espansione di C9orf72 (causa del 40% dei casi familiari e del 10% di quelli sporadici).

PPARγ-coactivator-1α gene transfer reduces neuronal loss and amyloid-β generation by reducing β-secretase in an Alzheimer’s disease model. PNAS 2016;113:12292. PGC-1α è un regolatore trascrizionaledi geni del metabolismo energetico che è in grado di ridurre la formazione di amiloide-β (Aβ) nelle colture cellulare i cui livelli sono ridotti nell’encefalo di persone con Alzheimer. La somministrazione di PGC-1α tramite vettore virale in alcune aree cerebrali di un modello di Alzheimer murino ha determinato una riduzione di formazione di placche Aβ riducendo così l’espressione dei principali enzimi della produzione di Aβ e di conseguenza proteggendo buona parte dei neuroni e normalizzando il profilo cognitivo dell’animale. Somministrazione selettiva di PGC-1α come possibile promettente terapia dell’Alzheimer?

Insulin resistance and diabetes caused by genetic or diet-induced KBTBD2 deficiency in mice. PNAS 2016;E6418. Nel topo mutazioni di KBTBD2 (Kelch Repeat And BTB Domain Containing 2) causa diabete insulino-resistente, lipodistrofia, steatosi epatica e deficit di crescita. In questo lavoro si dimostra che tale gene è un regolatore essenziale del pathway del segnale insulinico e modula la sensibilità all’insulina limitando l’eccesso di p85α, la subunità di regolazione di PI3K (fosfatidilinositolo-3-chinasi).

Central role for melanocortin-4 receptors in offspring hypertension arising from maternal obesity. PNAS 2016;113:12298. E’ noto che vi sia una correlazione tra obesità materna (evento che sta interessando un crescente numero di donne) in gravidanza e malattie metaboliche cardiorenali nei figli, tra cui l’ipertensione. In questo studio ricorrendo a topi geneticamente modificati si dimostra che l’ipertensione primaria di origine simpatica è secondaria all’esposizione precoce a obesità materna e che il pathway melanocortinco è un possibile target terapeutico.

CARATTERI-MALATTIE COMPLESSE/STUDI ASSOCIAZIONE
Genome-wide associations for birth weight and correlations with adult disease. Nature 2016;538:248. Il peso neonatale, influenzato da fattori fetali e materni e correlato con malattie metaboliche dell’adulto (diabete 2 e m. cardiovascolari), lo si ritiene dovuto solo all’impatto di condizioni ambientali sfavorevoli prenatale. In realtà non è così. Da questo studio con GWAS si osserva che almeno il 15% della varianza (indice di variabilità, ndr) del peso neonatale è dovuto a fattori genetici fetali e che la correlazione tra fenotipo di sovracrescita prenatale e malattia cardio-metabolica nell’adulto è in parte dovuta ad effetti genetici, precisandone i pathway, come quello del sistema di segnale insulinico, omeostasi glucidica, biosintesi del glicogeno e rimodellamento cromatinico.

Trans-ancestry meta-analyses identify rare and common variants associated with blood pressure and hypertension. Nature Genetics 2016;48:1151. Identificate 30 nuove regioni genetiche associate alla PA ed all’ipertensione, tra cui 3 rare missenso di RBM47, COL21A1 e RRAS con maggior effetto rispetto alle varianti comuni, e varie rare nonsenso e missenso di A2ML1 e ENPEP.
Meta-analysis identifies common and rare variants influencing blood pressure and overlapping with metabolic trait loci. Nature Genetics 2016;48:1162. Oltre ai loci già noti identificati 31 nuovi loci associati, con missenso rare o a bassa frequenza di 3 geni: NPR1, DBH e PTPMT1. I pathway interessati riguardano i caratteri cardiometabolici, la funzione vascolare e lo sviluppo.

The genetics of blood pressure regulation and its target organs from association studies in 342,415 individuals. Nature Genetics 2016;48:1171. Identificate 17 nuove associazioni, portando ad un totale di 66 loci, associati alla PA. SNP che frequentemente interessano elementi regolatori in cis del tono vascolare di molti tessuti.
Enhancer Variants Synergistically Drive Dysfunction of a Gene Regulatory Network In Hirschsprung Disease. Cell 2016;167:355. Domanda generale per le malattie complesse: “How do multiple noncoding variants with individually small effects synergize to cause a complex disease”? Sappiamo che l’Hirschsprung (HSCR) è geneticamente eterogeneo ma che comunque RET è il gene critico per questa patologia in quanto sue varianti codificanti patogene sono osservabili nel 21% dei pz, delezioni intrageniche nel 5% e varianti di enhancer in oltre 98%. In questo lavoro ricorrendo a studi in vitro e in vivo nell’uomo e nel topo si dimostra che varianti di 3 enhancer di RET agiscono in modo sinergico nel comportare il rischio di m. Hirschsprung, influenzando negativamente il legame con fattori di trascrizione (RARB, GATA2 e SOX10) e l’espressione di RET con conseguente coinvolgimento del suo intero network. Viene così dimostrato che varianti non codificanti funzionalmente indipendenti in un network regolatorio amplificano i loro limitati effetti fornendo così un modello per le malattie complesse.